全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)包含LacZ基因，在含有IPTG和X-gal的平板培養(yǎng)基上，可進行藍白斑篩選，適用于平端克隆。

全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)的產品組分包括pEASY®-Blunt Cloning Vector、Control Template、Control Primers、M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等，

產品特點：

快速：僅需5分鐘。

簡單：加入片段即可。

高效：陽性率高。

提供氨芐青霉素和卡那霉素兩種篩選標記，便于根據實驗選擇篩選標記。

測序引物：M13 Forward Primer，M13 Reverse Primer，T7 Promoter Primer。

T7 Promoter用于體外轉錄。

Trans1-T1感受態(tài)細胞轉化效率高，生長速度快，確保克隆數(shù)，節(jié)約選時間。

操作方法：

1、PCR產物的制備

(1)引物要求:引物不能磷酸化。

(2)酶的選擇:擴增產物為平端的高保真DNA聚合酶，如FasP/，KD Plus DNA Polymerase。

(3)反應條件:為了保證擴增產物的完整性，擴增反應需要5-10分鐘后延伸。反應結束后，電泳檢測PCR產物的量和質量如果擴增產物有多條帶，建議凝膠回收目的片段。

2、克隆反應體系

(1)加入

(2)輕輕混合，室溫(20℃-37℃℃) 反應5分鐘。反應結束后，將離心管置于冰

3、推薦克隆反應條件

· 最佳插入片段DNA量

載體與片段摩爾比=1:7

可以粗略地按照“1 kb 20 ng"的比例計算。(如1 kb加20 ng、1.5 kb加30 ng等)

· 最佳載體使用量:1μl

· 最佳反應體系:3-5 m，體積不足時可以補充無菌水。

· 最佳反應時間

(1)片段長度為0.1-1kb(含1 kb):5-10 min

(2)片段長度為 1-2 kb(含2 kb):10-15 min

(3)片段長度為 2-3 kb(含3 kb):15-20 min

(4)片段長度為3 kb 以上:20-30 min

· 最佳反應溫度:25℃，如片段是高GC含量，可以37℃反應。(推薦用PCR儀控溫)

4、轉化

(1) 加連接產物于50 m 7ans1-T1感受態(tài)細胞中(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產物)，輕彈混勻，冰浴20-30分鐘。

(2) 42℃水浴熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。

(3) 加250 ml平衡至室溫的SOC或LB培養(yǎng)基，200rpm、37℃培養(yǎng)1小時。

(4) 取8u500 mM IPTG和40 wl 20 mg/mlX-gal混合，均勻地涂在準備好的平板上，37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。

(5)待IPTG和X-gal被吸收后，取200ml菌液均勻地涂在平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)(為得到較多克隆，1.500xg離心1分鐘，棄掉部分上清，保留100-150 m，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板)。

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